I PEMF modulano miRNA in un modello cellulare nella malattia di Alzheimer

I PEMF modulano miRNA in un modello cellulare nella malattia di Alzheimer

 

Articolo originale:  https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5434238/

 Healthc Eng>, 2 maggio 2017;2017:2530270. doi: 10.1155/2017/2530270

Il campo elettromagnetico pulsato a bassa frequenza è in grado di modulare i miRNA in un modello cellulare sperimentale della Malattia di Alzheimer

Enrica Capelli ^1, 2, * , Filippo Torrisi ^1, 2 , Letizia Venturini ³ , Maria Granato ^1, 2 , Lorenzo Fassina ^2, 4 , Giuseppe Francesco Damiano Lupo ^1, 2 , Giovanni Ricevuti ³

Astratto

 

L’obiettivo del presente studio era di indagare gli effetti di un campo elettromagnetico pulsato a bassa frequenza (LF-PEMF) in un modello cellulare sperimentale di malattia di Alzheimer (AD) per valutare nuove terapie che contrastino la neurodegenerazione. Nella recente letteratura scientifica, è documentato che la stimolazione cerebrale profonda tramite campi elettromagnetici (CEM) modula l’attività neurofisiologica dei circuiti patologici e produce benefici clinici nei pazienti affetti da AD. I CEM vengono applicati per la rigenerazione tissutale grazie alla loro capacità di stimolare la proliferazione cellulare e le funzioni immunitarie attraverso la famiglia proteica HSP70. Tuttavia, gli effetti dei CEM sono ancora controversi e sono necessarie ulteriori indagini. I nostri risultati dimostrano la capacità del nostro LF-PEMF di modulare l’espressione genica nelle funzioni cellulari che sono disregolate nell’AD (ad esempio, BACE1) e che questi effetti possono essere modulati con diverse condizioni di trattamento. Di particolare rilevanza, ci concentreremo sui miRNA che regolano i pathway coinvolti nei disturbi degenerativi cerebrali.

Studio Completo

La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa a progressione irreversibile che colpisce principalmente le regioni ippocampali e neocorticali del cervello. Poiché l’incidenza dell’AD aumenta negli anziani e con l’allungamento della vita umana, questa malattia sta diventando uno dei principali problemi di salute associati all’invecchiamento [ 1 ]. Attualmente non esiste un trattamento efficace contro l’AD e la sua patogenesi rimane poco chiara [ 2 ]. Molti studi sull’AD hanno evidenziato il possibile coinvolgimento di cause genetiche [ 3 ], immunologiche [ 4 ] e ambientali [ 5 ]. Lo stress ossidativo, l’interruzione dell’omeostasi del calcio, fattori ormonali, l’infiammazione e le disregolazioni vascolari e del ciclo cellulare sono stati associati alla malattia [ 6 ]. Le principali anomalie microscopiche dell’AD, che costituiscono la base della diagnosi istologica, sono le placche di β -amiloide (Aβ ) e la degenerazione neurofibrillare (grovigli). In particolare, le placche neuritiche sono composte principalmente da Aβ secreta attraverso una scissione proteolitica aberrante della proteina precursore dell’amiloide (APP) [ 7 ]. Si verificano una progressiva e infine grave perdita neuronale, perdita sinaptica e gliosi reattiva nelle stesse regioni che sopportano il peso delle placche e dei grovigli. Il coinvolgimento dell’ippocampo e dell’amigdala nelle fasi precoci dell’AD causa disfunzioni sinaptiche, come il blocco della potenzializzazione a lungo termine (LTP), con conseguente danno dei processi di apprendimento e memoria [ 8 ].

D’altro canto, un nuovo studio sul cervello e sui campi elettromagnetici (CEM) ha dimostrato, in vivo, che i CEM potrebbero proteggere dal deterioramento cognitivo o migliorare la memoria nei topi [ 9 ], mentre altri studi in vitro hanno indicato un possibile ruolo dei CEM come copromotori della crescita tumorale [ 10 ].

Oltre all’età, alla storia familiare e all’ereditarietà, che sono considerati importanti fattori di rischio, evidenze emergenti suggeriscono che anche i fattori ambientali possono influenzare lo sviluppo e la progressione dell’AD, soprattutto per quanto riguarda la malattia sporadica che rappresenta la forma più diffusa. In generale, le condizioni fisiopatologiche all’interno di cellule, tessuti e organi possono essere influenzate da cambiamenti nel contesto elettromagnetico nella misura in cui anche il loro fenotipo e le loro funzioni possono essere alterati dall’esposizione a campi elettromagnetici [ 11 , 12 ]. Alcuni dati di letteratura indicano che i campi elettromagnetici sembrano svolgere un ruolo nell’eziologia dei disturbi neurodegenerativi, incluso l’AD [ 13 , 14 ]. È interessante notare che, sebbene il dibattito sui campi elettromagnetici sia ancora controverso, un campo pionieristico di ricerca nell’AD è la stimolazione cerebrale profonda tramite campi elettromagnetici, che sembra modulare l’attività neurofisiologica dei circuiti patologici e produrre benefici clinici nei pazienti con AD [ 15 ]. Di rilievo, negli ultimi anni, le tecniche di stimolazione cerebrale con campi elettromagnetici (EMF), come la stimolazione magnetica transcranica (TMS) (che interagisce in modo non invasivo con l’attività cerebrale), sono state sviluppate e applicate per il trattamento di malattie neurologiche. I cambiamenti corticali indotti dalla TMS hanno portato a una maggiore plasticità neurale. Infatti, un miglioramento dell’eccitabilità corticale cerebrale potrebbe indurre uno specifico fenomeno simile alla potenziazione, che consentirebbe la plasticità sinaptica e promuovere il recupero di una funzione degradata. Date queste premesse, vi è attualmente un crescente interesse nell’applicazione dei campi elettromagnetici come approccio terapeutico nei disturbi psichiatrici e neurologici [ 16 ]. Inoltre, i campi elettromagnetici potrebbero essere utilizzati clinicamente per ristabilire le prestazioni cognitive nei pazienti con ictus [ 17 , 18 ] e nei pazienti affetti da malattie neurodegenerative [ 19 , 20 ]. Attualmente, sono in corso vari studi clinici per indagare ulteriormente i possibili effetti positivi dei campi elettromagnetici e della TMS sull’AD ( www.clinicaltrials.gov ).

Nonostante l’uso significativo della stimolazione cerebrale nei trattamenti clinici, come accennato, gli effetti dei campi elettromagnetici sui sistemi biologici non sono completamente compresi. Infatti, è stato osservato che, a seconda della “dose” e della lunghezza d’onda dei campi elettromagnetici, gli effetti possono passare dalla citotossicità alla citoprotezione [ 21 – 23 ]. Come recentemente riportato [ 24 ], le onde elettromagnetiche sono in grado di modulare la funzione del citoscheletro e di promuovere la differenziazione neuronale delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo; in particolare, i campi elettromagnetici promuovono la differenziazione neuronale in vitro e la neurogenesi ippocampale in vivo attraverso la regolazione positiva dell’attività del canale Cav-1 [ 25 – 28 ], della β -III-tubulina, della MAP2 [ 29 ] e del fattore neurotrofico derivato dal cervello [ 30 ].

A livello molecolare, è stato postulato che i campi elettromagnetici possano influenzare lo stato redox all’interno delle cellule, evocando così una risposta generale allo stress [ 31 ] e aumentando l’espressione delle proteine ​​correlate allo stress [ 32 ]. Inoltre, è stato riportato che i campi elettromagnetici possono ritardare la senescenza cellulare [ 33 ]. Come precedentemente dimostrato su un modello di topi con AD, un trattamento con campi elettromagnetici ad alta frequenza ha indotto un miglioramento delle funzioni cognitive, attribuito a una maggiore rimozione delle placche amiloidi [ 9 ]. Al contrario, in un modello cellulare in vitro di AD che sovraesprime APP, i campi elettromagnetici prolungati hanno causato un aumento significativo della secrezione di A β _1–42 [ 34 ], uno dei frammenti derivati ​​da APP più inclini all’aggregazione [ 7 ].

Di interesse, è stato ampiamente dimostrato, in vitro, che sia i campi elettromagnetici a bassa che ad alta frequenza possono anche modulare l’espressione genica agendo sui meccanismi di regolazione sia trascrizionali che post-trascrizionali [ 35 – 37 ]. In questo contesto, sia in condizioni fisiologiche che patologiche, i meccanismi post-trascrizionali sono determinanti chiave della modulazione dell’espressione genica, poiché consentono un rapido adattamento dei livelli proteici alle mutevoli condizioni ambientali e possono influenzare in modo diverso il destino cellulare. Questi meccanismi includono l’implicazione di una classe di piccole molecole di RNA non codificanti, chiamate miRNA, in grado di regolare l’espressione genica principalmente mediante l’appaiamento delle basi al 3′-UTR di specifici mRNA bersaglio [ 38 ]. Considerando che si prevede che i miRNA regolino fino al 90% dei geni umani [ 39 ], la loro attività fisiologica è fondamentale per il mantenimento di condizioni di salute e la loro espressione aberrante è associata alle caratteristiche patologiche di molte malattie [ 38 , 40 ].

In particolare, l’mRNA rappresenta circa il 5% dell’RNA cellulare totale ed è scarsamente correlato ai livelli proteici. È sempre più chiaro che la traduzione dell’mRNA è un punto focale chiave della regolazione dell’espressione genica. Degno di nota per questo progetto, i miRNA regolano l’espressione di proteine ​​chiave coinvolte nella patogenesi dell’AD e l’espressione di alcuni miRNA è alterata nei pazienti con AD [ 41 – 45 ], suggerendo così che un sistema di regolazione disfunzionale basato sui miRNA possa rappresentare un nuovo fattore eziologico per l’AD. In particolare, un’alterazione di diversi miRNA è stata correlata all’insulto Aβ [ 46 ]. Molti altri miRNA stanno emergendo come regolatori dell’espressione non solo di APP ma anche di proteine ​​coinvolte in processi cellulari fondamentali come la clearance cellulare e i sistemi di controllo di qualità che sono alterati nell’AD [ 47 ]. Recentemente, è stato suggerito che i miRNA siano anche in grado di modulare i processi cognitivi e immunitari attraverso alterazioni dirette o indirette della segnalazione neurone-glia e/o cervello-corpo [ 48 ]. In linea con questo concetto, studi sull’espressione genica su soggetti con AD e di controllo hanno mostrato differenze in alcuni miRNA non solo nelle aree cerebrali colpite e nel liquido cerebrospinale, ma anche nei distretti periferici, come il sangue [ 49 ]. Molto recentemente, è stato osservato il potenziale contributo dei miRNA alla fisiopatologia dell’AD negli esseri umani e in vari modelli cellulari e animali [ 50 ]. Inoltre, molti studi hanno documentato la presenza di miRNA (e altri RNA) nello spazio extracellulare dopo il loro rilascio dalle cellule e nel sangue circolante. Questi miRNA sono contenuti in una varietà di strutture e complessi proteici/lipoproteici diversi [ 51 , 52 ]. I miRNA circolanti sembrano sfuggire alla degradazione tramite l’attività ribonucleasica endogena risiedendo in corpi strutturati a membrana e in complessi proteici e lipidici [ 53 ]. I miRNA si muovono precedentemente attraverso il flusso sanguigno da un distretto all’altro [ 54 , 55 ]. I miRNA circolanti sono emersi come candidati biomarcatori per un lungo elenco di malattie e condizioni mediche [ 56 ]. Pertanto, i miRNA possono rappresentare una messa a punto della segnalazione in grado di raggiungere diversi distretti corporei e in grado di integrare più input e output [ 57]. In questo scenario, una comprensione più approfondita della relazione tra AD, campi elettromagnetici e miRNA potrebbe aiutare a far luce sulle basi molecolari di questa patologia, aprendo anche la possibilità all’uso dei miRNA come potenziali biomarcatori clinici. Ad esempio, è stato dimostrato che la stimolazione elettromagnetica transcranica del cervello attraverso campi elettromagnetici pulsati (PEMF) può determinare la riattivazione dei processi cognitivi nei pazienti con AD e la riduzione di Aβ nei modelli di topi transgenici per APP [ 9 ].

Considerando queste precondizioni, le relazioni tra l’esposizione a campi elettromagnetici a bassa frequenza (LF-PEMF) e i miRNA che regolano le proteine ​​coinvolte nelle alterazioni funzionali nell’AD potrebbero spiegare le basi molecolari delle neuropatologie e indicare nuove terapie. I miRNA potrebbero essere utilizzati come farmaci per bloccare la produzione di proteine ​​dannose in nuove strategie terapeutiche, grazie alla loro capacità di downregolare l’espressione genica fino al silenziamento, attraverso l’interazione con i loro messaggeri bersaglio. È importante identificare i miRNA modulati dall’esposizione a campi elettromagnetici a bassa frequenza (LF-PEMF) al fine di caratterizzare i meccanismi associati all’AD. Infine, poiché esistono dati contrastanti sugli effetti dei campi elettromagnetici e diverse pubblicazioni trattano di azioni tossiche, sono necessari ulteriori studi sugli effetti dei campi elettromagnetici a bassa frequenza (LF-PEMF) per verificare se l’esposizione a determinati dosaggi possa indurre vantaggi terapeutici o, al contrario, costituire un ulteriore fattore di rischio.

Di conseguenza, lo scopo del nostro studio era valutare la modulazione dei miRNA indotta da LF-PEMF nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenute da pazienti con AD. L’esposizione alle PBMC è stata realizzata utilizzando un bioreattore elettromagnetico, con una frequenza di 75 Hz [ 58 ]. I miRNA significativi sono stati selezionati a seguito di una ricerca nei database miRBase, TarBase e miRTarBase. hsa-miR-107 regola l’enzima BACE1, che esercita la sua azione determinando la via amiloidogenica della proteina APP. Ricerche precedenti hanno identificato una ridotta espressione di miRNA 107 nei pazienti con AD; poiché questo miRNA regola negativamente BACE1, la sua minore espressione promuove la produzione di peptidi tossici Aβ 40 _e /o Aβ ₄₂ . Abbiamo quindi deciso di verificare se il trattamento con LF-PEMF portasse ad un aumento dell’espressione del miRNA 107 e, quindi, ad una minore produzione di peptidi tossici di A β , ottenendo un beneficio clinico.

Inoltre, abbiamo considerato altri miRNA significativi come hsa-miR-335-5p che ha come bersaglio il gene MAPK1, che codifica per una delle proteine ​​chinasi regolate da segnali extracellulari (ERK), una proteina attivata da mitogeni coinvolta nella crescita cellulare e nel potenziamento a lungo termine (LTP) e che agisce nella rigenerazione delle sinapsi. Lo stesso miRNA ha come bersaglio il gene GRIA1 (glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 1), che codifica per il recettore AMPA 1, essenziale per la prima fase di induzione dell’LTP. Di conseguenza, dopo stimolazione con LF-PEMF, una bassa espressione di miR-335, che determina un aumento di ERK e del recettore AMPA, può essere positiva sia per la rigenerazione cellulare che per i processi neurologici che regolano la memoria e l’apprendimento. hsa-miR-26b-5p regola l’espressione del gene SLC17A6, che codifica per il trasportatore vGLUT ₂ . Questo trasportatore deposita il glutammato nelle vescicole presinaptiche, che verrà rilasciato per raggiungere il terminale postsinaptico, dove può interagire con i recettori AMPA e NMDA. Abbiamo quindi deciso di determinare se l’azione del LF-PEMF possa modulare l’espressione di questo miRNA, poiché un possibile aumento dei livelli di vGLUT ₂ potrebbe causare un maggiore apporto di glutammato all’interno delle vescicole presinaptiche. Questo protegge il sistema nervoso dall’eccitotossicità del glutammato stesso e innesca i processi di LTP, migliorando la memoria e le funzioni cognitive.

1.1. Campi elettromagnetici e ROS nella malattia di Alzheimer

A livello molecolare, si è ipotizzato che i PEMF influenzino lo stato redox delle cellule, causando stress proteico [ 32 ]. Inoltre, l’attività antiossidante è modulata dai PEMF. Una stimolazione dell’attività antiossidante, dimostrata da una diminuzione del 58,31% della media del valore di malondialdeide e dal bilanciamento dello stato redox, è stata osservata in volontari sani [ 59 ]. L’equilibrio tra radicali liberi e antiossidanti (equilibrio redox) è un punto critico per il mantenimento dell’omeostasi in un sistema biologico: le specie reattive dell’ossigeno (ROS) ad alte dosi sono deleterie perché causano azioni patofisiologiche, mentre a basse dosi possono essere benefiche per le normali funzioni fisiologiche come la trasduzione del segnale, l’espressione genica e la regolazione della risposta immunitaria e per il rafforzamento dei meccanismi di difesa antiossidanti.

Durante gli esperimenti sui PBMC di pazienti con AD, è stato osservato che le onde elettromagnetiche causano una crescita della produzione totale di ROS; questo aumento sembra essere legato al momento dell’esposizione [ 61 ]. Lo stimolo applicato è in grado di determinare principalmente un forte aumento dei ROS fino al raggiungimento di un plateau e poi, una diminuzione con il tempo. Un aumento iniziale, legato al momento applicato, suggerisce un’amplificazione ROS-mediata della risposta infiammatoria [ 62 ]. La stessa tendenza è osservata nei neuroni coltivati ​​trattati con Aβ , suggerendo il ruolo dei CEM nell’ulteriore attivazione delle cellule che difendono il tessuto danneggiato da Aβ . Un aumento dei ROS potrebbe anche essere responsabile di un aumento dell’autofagia e della “clearance fagocitaria” da parte della microglia che può eliminare l’Aβ . L’aumento dei ROS potrebbe acquisire il ruolo di un “agente di innesco” in quanto responsabile della creazione di un precondizionamento finalizzato alla clearance di sostanze potenzialmente pericolose [ 63 ]. Quindi, il miglioramento cognitivo e la riduzione delle placche Aβ , dopo stimolazione con campi elettromagnetici, potrebbero dipendere principalmente dal potenziamento della risposta infiammatoria mediata dalle ROS dopo l’esposizione.

1.2. Campi elettromagnetici e plasticità sinaptica

Nonostante gli effetti dei PEMF siano ancora controversi, è stato dimostrato che la stimolazione cerebrale profonda mediante PEMF può modulare l’attività dei circuiti neurofisiologici producendo benefici clinici nei pazienti con AD [ 15 ]. Recentemente, le stimolazioni cerebrali con PEMF sono state sviluppate e applicate per il trattamento di disturbi neurologici: ad esempio, la stimolazione nota come TMS che interagisce in modo non invasivo con il sistema nervoso [ 17 ]. I cambiamenti corticali indotti dalle onde elettromagnetiche hanno mostrato risultati nel miglioramento della plasticità neuronale [ 18 ]. Infatti, un aumento dell’eccitabilità della corteccia cerebrale può influenzare il fenomeno dell’LTP, che a sua volta supporterebbe la plasticità sinaptica e promuoverebbe il recupero delle funzioni degenerate [ 64 ]. In queste precondizioni, c’è un crescente interesse nell’applicazione dei PEMF come possibile approccio terapeutico nei disturbi psichiatrici e neurologici [ 16 ]. I PEMF potrebbero essere utilizzati per ripristinare le prestazioni cognitive, ad esempio, negli studi clinici sull’AD. Recentemente, è stato dimostrato che le onde elettromagnetiche modulano le funzioni del citoscheletro e promuovono la differenziazione neuronale e la neurogenesi nell’ippocampo in vivo attraverso la sovra regolazione del canale Cav-1, della β -III-tubulina, della MAP2 e del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) [ 29 ]. Quest’ultimo è ampiamente espresso nel cervello e contribuisce a una varietà di processi neuronali che influenzano lo sviluppo neurologico, la sopravvivenza e il mantenimento dell’omeostasi del sistema nervoso negli anziani [ 27 ]. Nel cervello adulto, il BDNF svolge un ruolo chiave nella modulazione della plasticità sinaptica ed è essenziale per la regolazione della memoria. Per queste ragioni, i dati ottenuti supportano l’ipotesi che le onde elettromagnetiche possano migliorare la neuroplasticità cerebrale anche attraverso la modulazione dell’espressione dei fattori neurotrofici [ 64 ].

2. Materiali e metodi

2.1. Isolamento PBMC

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state ottenute dal sangue periferico di 13 pazienti affetti da AD mediante centrifugazione su un gradiente di densità 1077 (Histopaque® 1077, Sigma-Aldrich, Inc.). La frazione mononucleata è stata recuperata e risospesa alla concentrazione di 2,5 × 10 ⁶ cellule/ml in un terreno RPMI 1640 supplementato con il 10% di siero bovino e l’1% di penicillina/streptomicina (Euroclone, Logan, UT). La vitalità cellulare è stata valutata mediante il metodo di esclusione del colorante blu tripano; quindi, le PBMC sono state distribuite in una piastra multipozzetto da 96 (Corning) con una densità di 5 × 10 ⁵ cellule/200  μl di terreno/pozzetto e incubate a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO ₂ . Per ciascun paziente, 3 colture di PBMC sono state esposte a LF-PEMF per 3 durate diverse: 15, 30 e 60 minuti. Sono state allestite in parallelo colture di controllo non esposte (ovvero fittizie).

2.2. Esposizione del bioreattore elettromagnetico e dei PBMC a LF-PEMF

L’impostazione sperimentale del nostro bioreattore elettromagnetico era basata su due solenoidi (ovvero bobine con nucleo d’aria) collegati in serie e alimentati da un generatore di impulsi (BIOSTIM SPT Pulse Generator di IGEA, Carpi, Italia) [ 58 ]. I solenoidi avevano una forma quasi rettangolare (lunghezza, 17 cm; larghezza, 11,5 cm) e i loro piani erano paralleli a una distanza di 10 cm. Secondo il nostro modello matematico [ 65 ], questa distanza causava uno stimolo caratterizzato da un modulo di induzione magnetica di circa 3 mT. Inoltre, il campo di induzione magnetica era perpendicolare alla superficie in cui le cellule venivano seminate e crescevano; la frequenza del segnale era pari a circa 75 Hz.

2.3. Estrazione dell’RNA

L’RNA totale è stato estratto da cellule non trattate e trattate con LF-PEMF utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen GmbH, Hilden) secondo le istruzioni del produttore. L’RNA totale ottenuto dalle colture replicate di ciascun trattamento è stato raggruppato e la qualità dell’RNA è stata valutata determinando il numero di integrità dell’RNA (RIN) (TapeStation, Agilent Technologies). Un’analisi quantitativa dell’RNA è stata eseguita utilizzando metodi fluorimetrici mediante la piattaforma Qubit® (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) utilizzando il Quant-iT RNA Assay (intervallo di dosaggio dichiarato tra 5 e 100 ng; concentrazione iniziale del campione tra 250 pg/ μl e 100 ng/ μl ): 2 μl di RNA sono stati aggiunti a 198  μl della soluzione di lavoro ottenuta mescolando 1  μl di Qubit™ RNA Reagent con 199  μl di Qubit RNA Buffer. La quantificazione è stata eseguita dopo la calibrazione dello strumento con gli standard RNA Quant-iT (0 e 10 ng/ml).

2.4. PCR con trascrizione inversa in tempo reale (qRT-PCR)

La PCR quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa (qRT-PCR) è stata eseguita utilizzando cDNA ottenuto in seguito alla reazione di trascrizione inversa con il kit miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR: 4  μ l di RNA totale (5 ng/ μ l) sono stati aggiunti a 4  μ l di tampone di reazione 5x, 2  μ l di miscela enzimatica, 1  μ l di spike-in sintetico e 9  μ l di acqua priva di nucleasi; e la reazione è stata eseguita utilizzando un termociclatore (Bio-Rad, MJ Mini) per un ciclo di reazione a 42 °C per 60 min e 95 °C per 5 min, e i prodotti della reazione sono stati immediatamente raffreddati a 4 °C.

3. Risultati

Questo articolo si propone di indagare la capacità dei campi elettromagnetici a bassa energia (LF-PEMF) di modulare l’espressione di proteine ​​coinvolte nella malattia di Alzheimer. A tal fine, sono stati selezionati 3 diversi miRNA a seguito di un’analisi bioinformatica nel database specializzato miRTarBase. Inoltre, è stata effettuata una ricerca su PubMed per miRNA e malattia di Alzheimer. Due miRNA (miR-335-5p e miR-26b-5p) sono stati selezionati per il loro coinvolgimento nella segnalazione cerebrale, in particolare nell’assorbimento del glutammato e nell’LTP. miR-335-5p è in grado di ridurre la traduzione del messaggero MAPK1 (mitogen-activated protein kinase 1). Questo gene codifica per un membro della famiglia delle MAP chinasi, noto anche come chinasi regolata da segnali extracellulari (ERK), che funge da punto di integrazione per molteplici segnali biochimici ed è coinvolto in un’ampia varietà di processi cellulari come proliferazione, differenziamento, trascrizione, regolazione e sviluppo. L’attività di ERK contribuisce alla plasticità sinaptica; infatti, i segnali a cascata di ERK agiscono con un ruolo regolatore sul recettore del glutammato AMPA (AMPAR), un recettore transmembrana ionotropico non-NMDA per il glutammato caratterizzato da quattro tipi di subunità chiamate GRIA (glutamate receptor ionotropic AMPA, 1–4) [ 67 ]. Questo particolare recettore è coinvolto nella trasmissione sinaptica rapida del sistema nervoso centrale, è attivato dall’analogo artificiale del glutammato AMPA e rappresenta il recettore più comune nel sistema nervoso. È stato recentemente dimostrato [ 68 ] che l’attivazione di AMPAR promuove l’elaborazione non amiloidogenica di APP e sopprime la produzione neuronale di Aβ . In questo scenario, miR-335-5p è in grado di downregolare direttamente ERK che, a sua volta, regola AMPAR che è coinvolto nella prima fase dell’LTP.hsa-miR-26b-5p regola l’espressione di un gran numero di geni, tra cui è degno di nota il vettore vGLUT ₂ (SLC17A6) coinvolto nella promozione dell’LTP. Lo stesso miRNA downregola i recettori del kainato. Inoltre, miR-107 è stato preso in considerazione a causa di studi precedentemente riportati [ 39 ] che hanno osservato una ridotta espressione di questo miRNA nei pazienti con AD. Questo miRNA prende di mira il messaggero di BACE1 che è coinvolto nell’elaborazione di APP verso il peptide Aβ : un’espressione aumentata di miR-107 contrasterebbe la scissione di APP che si traduce in una minore deposizione di placche Aβ nel cervello. La capacità di un campo elettromagnetico di modulare l’espressione dei miRNA selezionati è stata testata su PBMC appena isolate dal sangue periferico di 13 pazienti con AD. Le cellule sono state esposte a LF-PEMF a 75 Hz per diverse durate (15, 30 e 60 min); successivamente, è stato estratto l’RNA totale ed è stato ottenuto il cDNA come descritto nella Sezione 2. Le espressioni quantitative di miR-107, miR-335-5p e miR-26b-5p sono state determinate mediante qRT-PCR utilizzando il piccolo RNA nucleolare U6 come riferimento endogeno, e i valori quantitativi di RQ sono stati calcolati rispetto alle colture di controllo non trattate applicando il metodo ΔΔct [ 66 ]. I risultati ottenuti sono mostrati nella Figura 1 : sono riportati i dati medi di 13 diverse colture di PBMC esposte per tempi diversi a LF-PEMF [3 mT; 75 Hz].

Figura 1.

Espressione di miR-107, miR-335 e miR-26b in PBMC di pazienti con AD determinata mediante quantificazione relativa RQ (campione trattato rispetto a campione di controllo). Sono mostrati i valori ottenuti dopo diversi tempi di esposizione (15, 30 e 60 min) ( P > 0,05). Possiamo osservare che l’esposizione a LF-PEMF è stata in grado di modulare l’espressione di tutti i miRNA considerati; in particolare, è stata osservata una progressiva riduzione di tutti i miRNA con l’aumentare del tempo di esposizione anche se le differenze tra cellule non trattate e trattate non erano statisticamente significative ( P > 0,05). Analogamente, l’espressione di BACE1 è influenzata da LF-PEMF con una progressiva riduzione dell’mRNA all’aumentare del tempo di esposizione ( Figura 2 ).

Figura 2.

Nella Figura 3 , vengono confrontati i valori di RQ di entrambi gli mRNA di miR-107 e BACE1 ottenuti in una delle colture di PBMC, prima e dopo il trattamento con LF-PEMF nelle diverse condizioni. Si può osservare che LF-PEMF induce una modulazione dell’espressione sia di miR-107 che di mRNA di BACE1. Inoltre, è stata osservata una modulazione diversa a seconda della durata dell’esposizione.

Figura 3.

Confronto dell’espressione di miR-107 e BACE1 nella stessa coltura di PBMC esposta a LF-PEMF (durate 15, 30 e 60 minuti). I risultati sono stati normalizzati dai valori di U6 per miR-107 e dai valori di GAPDH per BACE1. I valori di quantificazione relativa RQ sono stati calcolati rispetto ai controlli non trattati e riferiti alla media del rispettivo controllo non trattato.

4. Discussione

Secondo i dati attuali, LF-PEMF (3 mT; 75 Hz) ha dimostrato di essere in grado di modulare sia i miRNA che gli mRNA coinvolti nei percorsi correlati all’AD. I miRNA sono molecole che agiscono attraverso l’interazione complementare diretta con sequenze di RNA messaggeri (mRNA bersaglio) e sono in grado di interagire con un’ampia gamma di mRNA che condividono le stesse sequenze; ​​quindi, ogni miRNA può essere considerato il centro di una rete complessa che regola vari percorsi proteici. È stato osservato che miR-107 downregola oltre a BACE1 e altri mRNA che potrebbero essere coinvolti in disturbi degenerativi cerebrali, ad esempio GRN, CYP2C8, DAPK1 e PTEN. Dai dati della letteratura, le malattie associate a GRN (granulina) includono la degenerazione lobare frontotemporale con inclusioni ubiquitina-positive e l’afasia progressiva non fluente [ 69 ].

Il gene CYPP2C8 codifica un membro della superfamiglia di enzimi del citocromo P450; queste proteine ​​sono monoossigenasi che catalizzano molte reazioni coinvolte nel metabolismo dei farmaci e nella sintesi di colesterolo, steroidi e altri lipidi. DAPK1 (proteina chinasi 1 associata alla morte) è un gene responsabile dello sviluppo e della destabilizzazione della placca aterosclerotica. PTEN (omologo di fosfatasi e tensina) agisce come un oncosoppressore, inibendo la via di segnalazione AKT/PKB; inoltre, regola i livelli intracellulari di fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato nelle cellule. Un altro gene, la cui espressione è regolata da miR-107, è SP1, che codifica per un fattore di trascrizione a dita di zinco che lega i motivi ricchi di GC di molti promotori ed è coinvolto in molti processi cellulari, tra cui differenziamento cellulare, crescita cellulare, apoptosi, risposte immunitarie, riparazione del DNA e rimodellamento della cromatina.

Tra i target di miR-335-5p consideriamo particolarmente interessanti la tenascina C (TNC), una proteina della matrice extracellulare implicata nella guida dei neuroni migranti e degli assoni durante lo sviluppo, nella plasticità sinaptica e nella rigenerazione neuronale; RASA1 (attivatore della proteina RAS P21) che è un regolatore inibitorio della via Ras/AMP ciclico e stimola la GTPasi del Ras p21 normale ma non oncogenico; e IGFR1 (recettore del fattore di crescita insulino-simile 1), un recettore transmembrana che viene attivato da un ormone chiamato fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) e da un ormone correlato a IGF-1 chiamato IGF-2. Un altro interessante bersaglio di miR-335-5p è APBB2 (A β precursor protein binding family B member 2) che codifica una proteina che interagisce con i domini citoplasmatici della proteina precursore A β (A4) e della proteina precursore-simile A β (A4) 2. Quest’ultima proteina contiene due domini di legame alla fosfotirosina (PTB), che si ritiene funzionino nella trasduzione del segnale. Nella Tabella 1 sono elencati alcuni dei geni la cui espressione è regolata dai miRNA studiati (fonte: miRTarBase, miRDB).

Tabella 1.

MiRNA studiati e alcuni dei loro target coinvolti nei percorsi correlati all’AD.

ID	miRNA	Sequenza	Bersaglio
MIMAT0000104	hsa-miR-107	50-agcagcauuguacagggcuauca-72	PLAG1, BACE1, CDK6, GRN, DAPK 1, PTEN, NOTCH 2, NFIA, SERBP1
MIMAT0000765	hsa-miR-335-5p	16-ucaagagcaauaacgaaaaaugu-38	TNC, RASA1, IGFR1, SP1, APBB2
MIMAT0000083	hsa-miR-26b-5p	12-uucaaguaauucaggauaggu-32	SLC17A6, (DNP1/vGLUT 2 )

 

 

 

Note: gene pleiomorfo dell’adenoma 1; BACE1: enzima 1 che scinde l’APP nel sito beta; CDK6: chinasi ciclina-dipendente 6; GRN: granulina; DAPK 1: proteina chinasi associata alla morte 1; PTEN: omologo della fosfatasi e della tensina; NOTCH 2: Notch 2; NFIA: fattore nucleare I/A; SERBP1: proteina legante l’mRNA SERPINE1 1; TNC: tenascina C; RASA1: attivatore proteico RAS p21 (proteina attivante la GTPasi) 1; IGFR1: recettore del fattore di crescita insulino-simile 1; SP1: fattore di trascrizione Sp1; APBB2: membro 2 della famiglia B di legame della proteina precursore β A ; SLC17A6 (DNP1/vGLUT ₂ ): membro 6 della famiglia 17 dei trasportatori di soluti (trasportatore vescicolare del glutammato).

In conclusione, i risultati del presente studio, utilizzando un modello di PBMC umano ex vivo, hanno dimostrato che l’esposizione a LF-PEMF modula realmente l’espressione dei miRNA che regolano la segnalazione cerebrale, confermando così la capacità del campo elettromagnetico di stimolare sia la rigenerazione tissutale che la segnalazione cerebrale.

L’analisi delle variazioni nei livelli di espressione dei miRNA, noti come processi regolatori coinvolti nella segnalazione cerebrale e nella rigenerazione tissutale, dopo esposizione a LF-PEMF, ci ha permesso di verificare sia le variazioni quantitative di questi miRNA sia di identificare altri messaggeri bersaglio dello stesso miRNA. Ciò è stato possibile attraverso l’analisi dei network proteici in cui i miRNA sono coinvolti.

Infatti, ciascun miRNA può interagire attraverso complementarietà di sequenza con sequenze contenute in vari mRNA bersaglio e può anche agire in sinergia con altri miRNA che regolano lo stesso mRNA. I risultati del presente studio hanno confermato la capacità di LF-PEMF di influenzare diversi network di funzioni fisiologiche che risultano disregolate nell’AD. Tra gli effetti osservati, una riduzione quantitativa della β -secretasi, in seguito all’esposizione a LF-PEMF, potrebbe confermare un’azione protettiva del campo elettromagnetico la cui azione contrasterebbe la formazione di Aβ.

I valori di espressione di miR-107, che è un regolatore negativo di BACE1, diminuiscono con l’aumentare del tempo di esposizione, e la stessa tendenza è stata osservata per l’espressione di miR-26b-5p, che è coinvolto nella segnalazione cerebrale e nella plasticità sinaptica.

Diversamente, l’espressione di miR-335-5p, che regola negativamente il recettore AMPA, viene stimolata dal campo elettromagnetico, anche se questa espressione diminuisce con l’aumentare del tempo di esposizione. Questo risultato indica un possibile effetto avverso dipendente dal tempo di esposizione.

Nel complesso, i risultati ottenuti dallo studio sul nostro modello in vitro hanno dimostrato che i campi elettromagnetici a bassa frequenza (LF-PEMF) possono stimolare una regolazione epigenetica mediata dai miRNA, che porterebbe a un riequilibrio della deregolazione dei pathway che si verifica nell’AD (questa deregolazione inizia nel locus coeruleus e poi continua nelle aree di associazione di ordine superiore della neocorteccia [ 70 ]).

Tuttavia, è necessario tenere conto della complessa rete di segnali epigenetici, non ancora completamente nota, e della possibilità di alcuni effetti avversi.

Questi risultati suggeriscono che i campi elettromagnetici a basse frequenze, se utilizzati correttamente, possono essere utili per il trattamento dei pazienti con AD, come suggerito dai risultati di esperimenti pilota con stimolazione cerebrale profonda tramite CEM, che sono stati segnalati per produrre benefici clinici [ 15 ].